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中国农科院Nature子刊CRISPR新成果

2019-07-08 03:25

  时间:2016年04月06日来历:生物通

  4月1日,Nature旗下子刊《Scientific Reports》在线颁发了中国农科院作物科学研究所与安徽农业大学的一项研究功效。在这项研究中,研究人员在不变转化的动物中,成功地制备了一种基因/替代系统,可将感乐趣的基因用于方针作物的遗传改良。

  生物传递道:切确的DNA/基因替代,是一种很有前景的基因组编纂东西,很容易推广到分子工程和设想育种。目前,CRISPR/Cas9系统可以或许很好地作为一种东西用于动物基因敲除,例如:中国农科院用CRISPR实现大豆基因组编纂安徽农科院用CRISPR编纂水稻基因基因组编纂手艺在动物基因功能判定及作物育种中的使用。然而,动物中的基因替代却很少有报道。

  4月1日,Nature旗下子刊《Scientific Reports》在线颁发了中国农科院作物科学研究所与安徽农业大学的一项研究功效,题为“An alternative strategy for targeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9 design”。在这项研究中,研究人员在不变转化的动物中,成功地制备了一种基因/替代系统,可将感乐趣的基因用于方针作物的遗传改良。本文通信作者是中国农科院作物科学研究所的谢传晓博士,作物科学研究所的徐云碧研究员、毛龙研究员也是本文配合作者。

  用于切确的靶向基因组编纂的简单方式,可能在动物的基因功能判定和遗传改良方面有着主要的使用价值。近年来,大范畴核酸酶1、锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs),已被开辟作为序列特同性核酸酶,用于将靶向双链断裂(DSBs)导入DNA,以让我们通过内源性的DNA毁伤修复路子,进行基因编纂。

  比来,有研究人员基于CRISPR相关核酸酶系统,开辟出一种新的RNA指导性基因编纂东西。CRISPR/Cas9核酸酶系统,能够用一个嵌合RNA(一个所谓的单导向RNA,sgRNA)靶定特定的基因组位点,与卵白质指导的靶向东西比拟,具有更高程度的靶向选择矫捷性。CRISPR/Cas9系统已被证明能推进分歧物种的基因组编纂,包罗哺乳动物(包罗人类)、微生物和动物。

  利用CRISPR/Cas9实现的基因敲除,代表着这个系统的最早使用,由于由Cas9诱导的DSBs,可通过一种非同源结尾毗连(NHEJ)机制而得以修复,这是一种容易犯错的修复路子,可能会在DNA修复过程中引入短的缺失或插入。HDR(homology-directed修复),是修复染色体中DSBs的一种替代方式,对于动物基因组工程更有吸引力,由于它能够实现更微妙的DNA序列点窜,包罗DNA批改、靶向基因敲入或改换,或任何类型的突变。

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  HDR依赖性靶基因置换或敲入,为基因组编纂供给了一个史无前例的机缘,但也更有挑战性,由于靶向DSB(s) 必需和一个修复模板共存。能够通过利用一对TALENs或sgRNAs与Cas9核酸酶,发生靶向的基因组缺失突变。诱导的双重DSB毁伤或缺失突变,也是靶向基因替代的一个必备步调。

  据报道,在一种体外系统中,CRISPR/Cas9可在烟草(N . benthamiana)原生质体中成功实现HDR介导的基因替代。也有研究在玉米中操纵CRISPR/Cas9,通过HDR,将一个特征基因插入到一个靶向的DSB毁伤部位,并用Cas9和sgRNA表达组件配合“轰击”DNA供体修复模板,以确保有足够的供体拷贝出此刻靶细胞中。粒子轰击策略的长处在于,能够供给很多供体模板的副本。然而,该当在后续步调中处置方针生物中的转换拷贝,来自载体的一部门DNA序列,可能是领受者基因组的污染物。

  CRISPR/Cas9的不变变换,和一个包含基因组编纂需要元素的载体(通过农杆菌介导的转化),能够通过识别“非转基因”生物很容易地筛选出来。关于HDR介导的基因打靶,Fauser等人证明,核酸酶和暗语酶系统都是无效的东西。当配对部位互相接近时,切确设想相邻配对的sgRNA/Cas9暗语酶——这可能有加强特同性的长处,可被用于靶定基因插入、基因堆叠和基因敲入。然而,迄今为止,还没有研究在动物中建立体内靶向基因替代事务,同时具有较低的转基因污染风险。

  在这项研究中,研究人员通过一对sgRNAs的同时传送,来靶定两个MIRs(AtMIR169a和AtMIR827a)的两个侧翼区。他们起首设想了一个双重sgRNA/Cas9载体组合(construct# 1),成功地删除了miRNA基因区域——MIR169a和MIR827a。通过PCR和随后的测序,研究人员验证了这些缺失,从而在MIR169a和MIR827a位点别离发生了20%和24%的删除效率。

  然后,他们通过CRSPR/Cas9和一个DNA修复供体模板的不变转换,实现了一个目标基因的靶向替代,此中不异的sgRNA靶位点被设想为删除动物靶基因,并删除推进HDR的DNA供体。这些研究成果展现了一种替代策略,利用CRSPR/Cas9系统,通过基因替代进行基因组编纂。

  (生物通:王英)

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